Formation au métabarcoding avec BARQUE

De l’assurance qualité à l’assignation taxonomique

Steve Vissault

steve.vissault@inrs.ca

Institut National de la Recherche Scientifique (INRS)

2025-10-21

Objectifs de la formation

Comprendre le séquençage Illumina et les fichiers FASTQ
Manipuler des données de séquençage avec R
Découvrir BARQUE, un pipeline de métabarcoding québécois
Appliquer les concepts sur des exemples pratiques

Avant de commencer

Installation des librairies R requises

Ouvrir RStudio
Envoyer les commandes suivantes dans la console

# Installation des packages Bioconductor
if (!require("BiocManager", quietly = TRUE))
    install.packages("BiocManager")

BiocManager::install(c("ShortRead", "Biostrings", "Rqc"))

Introduction

Comment le séquencage est effectué?

Comment le séquencage est effectué?

Note

Chaque nucléotide à un fluorophore spécifique (4 canaux).
Certains appareils (ex. NextSeq) vont utiliser deux canaux car c’est plus rapide et moins coûteux.

Le signal renvoyé par le laser est traduit en chromatographe pour chaque amplicon séquencé.

Comment le séquencage est effectué?

Exemple de chromatographe

Source: LabXchange.org

Comment le séquencage est effectué?

Exemple de chromatographe

Important

Le score est basé sur:

La séparation entre les clusters (pureté du signal)
Le rapport signal/bruit
La distribution de l’intensités des 4 canaux
La position dans le read (la qualité diminue généralement vers la fin)

Les fichiers FASTQ

Les sortie du séquenceur Illumina

Fichiers de sortie du séquenceur Illumina

Exemple de nomenclature de fichier de sortie du séquenceur Illumina: sample1_1_L001_R1_001.fastq.gz

	Signification	Exemple
sample1	Identifiant de l’échantillon	sample1, sample2
_1	Numéro de réplicat	1, 2, 3…
L001	Numéro de ligne / lane:	L001-L008
R1/R2	Direction de lecture	R1=avant, R2=arrière
001	Segment de fichier	001, 002…

Note

Séquençage paired-end = fichiers R1 + R2 pour chaque échantillon avec l’ensemble des amplicons.
Numéro de Ligne ou lane = Une flowcell Illumina est divisée en plusieurs voies physiques parallèles où le séquençage se déroule simultanément.

Structure du fichier FASTQ

Contient plusieurs lignes dont un ensemble de 4 lignes correspond à un amplicon.

system.file(package="ShortRead", "extdata/E-MTAB-1147/ERR127302_1_subset.fastq.gz") |> 
  gzfile() |> 
  readLines(n = 12)

 [1] "@ERR127302.8493430 HWI-EAS350_0441:1:34:16191:2123#0/1"                  
 [2] "GTCTGCTGTATCTGTGTCGGCTGTCTCGCGGGACATGAAGTCAATGAAGGCCTGGAATGTCACTACCCCCAG"
 [3] "+"                                                                       
 [4] "HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHEBDBB?B:BBGG<DDAA?AABFEFBDBD@DDECEE3>:?;@@@>?=BAB?##"
 [5] "@ERR127302.21406531 HWI-EAS350_0441:1:88:9330:2587#0/1"                  
 [6] "CTAGGGCAATCTTTGCAGCAATGAATGCCAATGGGTAGCCAGTGGCTTTTGAGGCCAGAGCAGACCTTCGGG"
 [7] "+"                                                                       
 [8] "IIIIHIIIGIIIIIIIHIIIIEGBGHIIIIHGIIHIIIIIIIHIIIHIIIIIGIIIEGIIGBGE@DDGGGIG"
 [9] "@ERR127302.22173106 HWI-EAS350_0441:1:91:10434:14757#0/1"                
[10] "TGGGCTGTTCCTTCTCACTGTGGCCTGACTAAAACCCAGTGGCATTAAGAAAGAGTCACGTTTCCCAAGTCT"
[11] "+"                                                                       
[12] "GGHBHGBGGGHHHHDHHHHHHHHHFGHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHGHFHHHHHHHHHHHHHH8AGDGGG>"

Structure du fichier FASTQ

system.file(package="ShortRead", "extdata/E-MTAB-1147/ERR127302_1_subset.fastq.gz") |> 
  gzfile() |> 
  readLines(n = 4)

[1] "@ERR127302.8493430 HWI-EAS350_0441:1:34:16191:2123#0/1"                  
[2] "GTCTGCTGTATCTGTGTCGGCTGTCTCGCGGGACATGAAGTCAATGAAGGCCTGGAATGTCACTACCCCCAG"
[3] "+"                                                                       
[4] "HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHEBDBB?B:BBGG<DDAA?AABFEFBDBD@DDECEE3>:?;@@@>?=BAB?##"

Ligne [1] : Identifiant de séquence (commence par @)
Ligne [2] : Séquence d’ADN (A, T, G, C) de l’amplicon
Ligne [3] : Séparateur (+)
Ligne [4] : Scores de qualité (un par base)

Ligne d’identification

Décomposition de l’identifiant

@SH00321:6:BWR98207-2813:1:1101:1065:1015 1:N:0:AACCATAGAA+GGCGAGATGG

SH00321 : ID de l’instrument
6 : Numéro d’exécution
BWR98207-2813 : ID de la flowcell
1:1101:1065:1015 : Tuile et coordonnées X:Y
1:N:0 : Numéro de lecture, flag de filtre, bits de contrôle
AACCATAGAA+GGCGAGATGG : Codes-barres d’échantillon (double indexation)

Interprétation des scores de qualité

Exemple de chaine de caractères donnant le score de qualité (1 caractère par nucléotide): GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG9GG-G9G9G9GGGG

Caractère ASCII	Score Phred	Taux d’erreur	Précision
`G`	38	0,016%	99,984%
`9`	24	0,40%	99,60%
`-`	12	6,31%	93,69%

Tip

Règle générale : Q30 ou plus = haute qualité (99,9% de précision)

Scores de qualité du séquencage

Les scores de qualité utilisent l’encodage ASCII.

 Quality encoding: !"#$%&'()*+,-./0123456789:;<=>?@ABCDEFGHI
                   |         |         |         |         |
    Quality score: 0........10........20........30........40

Scores de qualité du séquencage

Avec R, comment convertir l’encodage ASCII en score de Phred et en probabilité d’obtenir une erreur (précision)?

# Convertir la chaîne de qualité en scores Phred
quality_string <- "GGGGGGG99GG-GGG"
quality_scores <- as.integer(charToRaw(quality_string)) - 33

# Afficher la correspondance
data.frame(
  Caractere = strsplit(quality_string, "")[[1]],
  Score_Phred = quality_scores,
  Precision = paste0(round((10^(-quality_scores/10)) * 100, 2), "%")
)

Scores de qualité du séquencage

   Caractere Score_Phred Precision
1          G          38     0.02%
2          G          38     0.02%
3          G          38     0.02%
4          G          38     0.02%
5          G          38     0.02%
6          G          38     0.02%
7          G          38     0.02%
8          9          24      0.4%
9          9          24      0.4%
10         G          38     0.02%
11         G          38     0.02%
12         -          12     6.31%
13         G          38     0.02%
14         G          38     0.02%
15         G          38     0.02%

Manipuler des fichiers FASTQ

Lire un fichier FASTQ avec R

# Lire le fichier FASTQ
fq <- system.file(package="ShortRead", "extdata/E-MTAB-1147/ERR127302_1_subset.fastq.gz") |> ShortRead::readFastq()

# Examiner la structure
fq

class: ShortReadQ
length: 20000 reads; width: 72 cycles

Extraire les informations principales

# Nombre d'amplicons
length(fq)

[1] 20000

# Extraire les amplicons
sequences <- ShortRead::sread(fq)

# Extraire les identifiants
ids <- ShortRead::id(fq)

# Extraire les scores de qualité
qualities <- Biostrings::quality(fq)

# Premier identifiant et séquence
ids[1]

BStringSet object of length 1:
    width seq
[1]    53 ERR127302.8493430 HWI-EAS350_0441:1:34:16191:2123#0/1

sequences[1]

DNAStringSet object of length 1:
    width seq
[1]    72 GTCTGCTGTATCTGTGTCGGCTGTCTCGCGGGAC...GTCAATGAAGGCCTGGAATGTCACTACCCCCAG

Résumé statistique d’un fichier FASTQ

# Longueur des séquences
seq_lengths <- Biostrings::width(sequences)
summary(seq_lengths)

   Min. 1st Qu.  Median    Mean 3rd Qu.    Max. 
     72      72      72      72      72      72

# Distribution des scores de qualité
qual_matrix <- as(qualities, "matrix")
mean_quality <- rowMeans(qual_matrix)
summary(mean_quality)

   Min. 1st Qu.  Median    Mean 3rd Qu.    Max. 
   2.00   33.53   37.35   34.84   38.85   39.99

# Composition en bases
Biostrings::alphabetFrequency(sequences, as.prob = TRUE)[1:4, 1:4]

             A         C         G         T
[1,] 0.1944444 0.2638889 0.2916667 0.2500000
[2,] 0.2361111 0.2222222 0.3194444 0.2222222
[3,] 0.2361111 0.2638889 0.2222222 0.2777778
[4,] 0.2500000 0.2638889 0.1666667 0.3194444

Assurance qualité avec la librairie `Rqc`

fq_files <- system.file(package="ShortRead", "extdata/E-MTAB-1147/") |> list.files(full.names = TRUE)
qa <- Rqc::rqcQA(fq_files)
Rqc::rqcCycleQualityPlot(qa)

Analyser la qualité du séquencage

Pourquoi la qualité des lectures décroit au fur et à mesure des itérations?

Dégradation des fluorophores
Accumulation d’erreurs de phase, soit la désynchronisation des clusters
Épuisement des réactifs, compétition pour les nucléotides par exemple
Dommages à l’ADN par stress chimique par exemple
Accumulation de sous-produits (ex. Résidus de réaction s’accumulent)

Points clés à retenir

FASTQ = format standard pour les données de séquençage
4 lignes par lecture d’amplicon : ID, lecture de l’amplicon, séparateur, qualité de la lecture
Paired-end : les fichiers R1 et R2 contiennent les lecture d’amplicons à apparier
Scores de qualité : Plus élevé = meilleur (viser Q30+)
La qualité se dégrade vers la fin des lectures (normal)

Traiter les amplicons séquencés avec BARQUE

Qu’est ce que BARQUE?

Un large éventail d’outils en bioinformatique

Hakimzadeh et al, 2024

Qu’est ce que BARQUE?

Programme écrit par Éric Normandeau (IBIS, ULaval)
Disponible sur Github depuis 2017
C’est un pipeline de traitement de données de séquences
Il agit comme chef d’orchestre d’un ensemble de programme

Qu’est ce que BARQUE?

FLASH v1.2.11+: fusion des lectures paired-end
VSEARCH v2.14.2+: outil d’analyse de séquences (version obligatoire)
Trimmomatic: outil de filtrage et découpage des lectures
NCBI BLAST: annotation des séquences non-correspondantes
Un ensemble de programmes UNIX comme cut, sort, uniq etc. qui manipulent des chaînes de caractères ou des nombres
R & Pyhton: Visualisation et synthèse des résultats

Les grandes étapes de BARQUE

Vérification des fichiers des entrées dans le
TRIM - Nettoyage/découpage des séquences
MERGE - Fusion des lectures paired-end (R1 et R2)
Split Amplicon - Séparation des amplicons (TODO ASV vs OTUs)
Retrait des chimères - Détection et suppression des séquences chimériques
Assignement taxonomique - Attribution des espèces

Télécharger BARQUE

Pratique

On se

Les étapes en tant qu’utilisateur

On place les fichiers fastq.gz avec la bonne nomenclature dans le dossier

Types de primer

Test

Espèces intégré à la base de données par PRIMER

COI

Aller chercher la base de données NCBI pour les primers COI

Pourquoi utiliser docker

BARQUE requière plusieurs programmes qui ne sont pas tous compatibles avec l’environnement Windows

Hakimzadeh et al, 2024

Comment docker fonctionne avec -v

Mettre un schéma

Étape 1. Télécharger l’image docker

–

Formation au métabarcoding avec BARQUE

Objectifs de la formation

Avant de commencer

Installation des librairies R requises

Introduction

Introduction

Comment le séquencage est effectué?

Comment le séquencage est effectué?

Comment le séquencage est effectué?

Exemple de chromatographe

Comment le séquencage est effectué?

Exemple de chromatographe

Les fichiers FASTQ

Fichiers de sortie du séquenceur Illumina

Structure du fichier FASTQ

Structure du fichier FASTQ

Ligne d’identification

Interprétation des scores de qualité

Scores de qualité du séquencage

Scores de qualité du séquencage

Scores de qualité du séquencage

Manipuler des fichiers FASTQ

Lire un fichier FASTQ avec R

Extraire les informations principales

Résumé statistique d’un fichier FASTQ

Assurance qualité avec la librairie Rqc

Analyser la qualité du séquencage

Pourquoi la qualité des lectures décroit au fur et à mesure des itérations?

Points clés à retenir

Traiter les amplicons séquencés avec BARQUE

Qu’est ce que BARQUE?

Un large éventail d’outils en bioinformatique

Qu’est ce que BARQUE?

Qu’est ce que BARQUE?

Les grandes étapes de BARQUE

Télécharger BARQUE

Pratique

Les étapes en tant qu’utilisateur

Types de primer

Espèces intégré à la base de données par PRIMER

COI

Pourquoi utiliser docker

Comment docker fonctionne avec -v

Étape 1. Télécharger l’image docker

Étape 2. Execute l’image

Assurance qualité avec la librairie `Rqc`